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一、实验目的

1．了解从茶叶中提取咖啡因的原理和方法，了解咖啡因的一般性质。

2．了解并掌握如何利用升华方法纯化固体产物的方法和原理。

3．掌握用索氏提取器或恒压滴液漏斗液-固萃取装置提取有机物的原理及操作方法。

4．进一步熟悉萃取、蒸馏、升华等的基本操作。

5．了解紫外—可见分光光度计的基本原理、仪器结构，掌握紫外—可见分光光度计的使用。

6．应用紫外—可见分光光度计定量测定咖啡因的含量，学习紫外吸收光谱定量分析方法。

二、实验原理

茶叶是人类最佳的天然保健饮料，茶叶中含有机化合物450多种，无机矿物质15种以上，及人体必需的营养成分和药用成分，茶对血管硬化，高血压、动脉粥样硬化、放射损伤、肿瘤、免疫功能降低的防治都有效，这是其他饮料无法取代的。在我国茶叶栽培，加工的历史源远流长，随着现代科技的发展，对茶叶的研究越来越深，对咖啡因的研究最多。茶叶中含有多种生物碱，其中主要成分为咖啡因，干茶叶中的咖啡因含量按重量计约可达2～5%，另外还含有单宁酸（或称鞣酸）约占11%~12%，色素、纤维素、蛋白质等约占0.6%。

咖啡因(Caffeine)是一种重要的医药工业原料，具有兴奋神经中枢，消除疲劳，减弱酒精、烟碱、吗啡等物质的毒害，增加肾脏血流量，利尿和强身等作用，但过量的咖啡因可以使精神疲倦，身体发颤，难以入睡，刺激胃黏膜，产生轻度上瘾。咖啡因主要用作中枢神经兴奋药，也是复方阿斯匹林（A.P.C）等药物的组分之一。现代制药工业多用合成方法来制得咖啡因。

咖啡因是存在于茶叶、咖啡、可可以及某些植物中的生物碱之一，分子式为C8H10N4O2，化学名称为1,3,7-三甲基-2,6-二氧嘌呤，为嘌呤衍生物，呈弱碱性。在植物中，咖啡因常与有机酸、丹宁等结合呈盐的形式而存在。咖啡因（含结晶水时）是无色针状结晶，味苦，能溶与水（2%）、乙醇（2%）、氯仿（12%）、苯（1%）等，在100℃时即失去结晶水并开始升华，120℃时升华显著，178℃以上升华加快。无水咖啡因的熔点是238℃。其结构式与茶碱，可可碱类似。

目前从茶叶中提取天然咖啡因的主要方法有：水提法、醇提法、升华法、有机溶媒提取法及超声波震荡提取法等。本实验中采用95%乙醇在索氏提取器中连续抽提茶叶中的咖啡因，将不溶于乙醇的纤维素和蛋白质分离。萃取液中除了咖啡因外，还有叶绿素、单宁及其水解物等。蒸除溶剂后，在粗咖啡因中拌入石灰，与单宁等酸性物质反应生成钙盐，而游离的咖啡因可以通过升华法纯化。

索氏提取器的工作原理：利用溶剂回流和虹吸原理，使固体物质每一次都能为纯的溶剂所萃取，所以萃取效率较高。萃取前应先将固体物质研磨细，以增加液体浸溶的面积。然后将固体物质放在滤纸套内，放置于萃取室中。当溶剂加热沸腾后，蒸汽通过导气管上升，被冷凝为液体滴入提取器中。当液面超过虹吸管最高处时，即发生虹吸现象，溶液回流入烧瓶，因此可萃取出溶于溶剂的部分物质。就这样利用溶剂回流和虹吸作用，使固体中的可溶物富集到烧瓶内。

茶叶中咖啡因含量测定常用的方法有液相色谱法或者紫外分光光谱法。本实验室采用紫外分光光谱法，主要原因是紫外分光光谱法方法简单，快速稳定、准确、灵敏度高、干扰物排除能力强。

紫外—可见分光光度计的基本工作原理：利用一定频率的紫外—可见光照射被分析的物质，物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁而产生的吸收光谱。一组吸收随波长而变化的光谱，反映了试样的特征。在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。

紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯—比尔（Lambert-Beer）定律。当一束平行单色光照在均匀的非散射性的吸光溶液上时，溶液对光的吸收程度与吸光物质的浓度及溶液厚度成正比。即：

A=ε b c

式中：A——吸光度；

c——吸光物质浓度；

b——液层厚度；

ε——摩尔吸光系数，其数值与入射光波长、吸光物质的性质及温度有关。

根据朗伯-比尔定律，若入射光的波长、吸光溶液厚度一定时，从测得的吸光度大小即可求的相应的吸光物质浓度的大小。咖啡因易溶于无水乙醇，在273 nm左右有强烈的吸收。用紫外可见分光光度计在273 nm测定咖啡因的吸光度值，根据咖啡因的标准曲线求得提取物咖啡因的含量。

三、实验仪器及试剂

仪器：紫外—可见分光光度计，索氏提取器，蒸馏装置，电热套，直形冷凝管，250 mL圆底烧瓶，50 mL容量瓶，蒸发皿，研钵，石棉网，烧杯，滤纸等。

试剂：茶叶（10 g），95%乙醇（80 mL），氧化钙（4 g），咖啡因（纯度不低于99%）标准储蓄液（0.5 mg·mL-1）。

四、实验装置

索氏提取装置 滴液漏斗提取装置 简单升华装置

五、实验内容

1．提取

方法一：索氏提取器提取

（1）将一张长、宽各约12－13厘米的方形滤纸卷成直径略小于索氏提取器提取腔内径的滤纸筒，一端用棉线扎紧。称取10克茶叶末（事先把茶叶放入研钵中研碎，一定要细！）放入筒内，压实。在茶叶上盖一张小圆滤纸片（或脱脂棉），将滤纸筒上口向内折成凹形，以保证回流液均匀地浸透被茶叶末。将滤纸筒放入提取腔中去，使茶叶装载面低于虹吸管顶端。装上回流冷凝管。在圆底烧瓶中加入60毫升95%乙醇，投入两粒沸石，如图80-1装置。

（2）加热烧瓶，乙醇沸腾后蒸气经侧管升入冷凝管，冷凝下来的液滴滴入滤纸筒中。当液面升至虹吸管顶端相平齐时即经虹吸管流回平底烧瓶中。连续提取约1.5小时，至提取液颜色很淡时为止。当最后一次虹吸刚刚过后，立即停止加热。

（3）稍冷后改成蒸馏装置，回收提取液中的大部分乙醇（约剩10－15mL，太少，转移时损失大）。

方法二：恒压滴液漏斗提取

（1）如图安装好连续提取装置。恒压滴液漏斗下端塞少许脱脂棉（勿塞太多太紧，否则液体流速慢），称取10 g茶叶，研细后，放入恒压滴液漏斗中。

（2）关闭恒压滴液漏斗的活塞，在恒压漏斗中加入20 mL 95%乙醇，在圆底烧瓶中加入60 mL 95%乙醇和1粒沸石，用水浴加热回流，回流液进入恒压滴液漏斗中，浸泡茶叶。

（3）待漏斗中液体积聚一定量之后，打开漏斗活塞，使提取液回流入圆底烧瓶内。

（4）关闭漏斗活塞，使回流液再进入滴液漏斗浸泡茶叶，积累一定量后再放入圆底烧瓶。如此反复数次直至浸泡液颜色变得较浅。

（5）最后一次将烧瓶内的乙醇蒸入滴液漏斗后（或改为蒸馏装置），回收蒸出的乙醇，烧瓶内剩余约10-15 mL液体。

2．升华

（1）将蒸馏瓶中的浓缩液趁热倒入蒸发皿中（蒸馏瓶壁附着的提取物可用少量回收的热乙醇洗涤，一并倒入蒸发皿中），加4g生石灰粉末，搅成糊状。将蒸发皿放在一盛有沸水的烧杯上，用蒸气浴蒸干，不断搅拌，并压碎块状物，最后移至石棉网上焙炒片刻以除去全部水分。

（2）将一张刺有许多小孔且孔刺向上的滤纸覆盖再在蒸发皿上，滤纸上罩一个大小合适的玻璃漏斗,漏斗颈部塞一小团疏松的棉花，用酒精灯隔着石棉网小心加热，使咖啡因升华。当滤纸上出现白色针状结晶时，要适当调节火焰使升华速度放慢。若发现有棕色烟雾时，应立即停止加热。冷却后揭开漏斗和滤纸，用刮刀小心地把附在纸上及器皿周围的白色毛状结晶刮在表面皿上。

（3）残渣经拌和后用较大的火再加热片刻，使升华完全。合并两次收集的咖啡因，称重，计算咖啡因在茶叶中的含量，并测定熔点。

3．咖啡因的定性检验

（1）与生物碱试剂：取咖啡因结晶的一半于小试管中，加5mL水，微热，使固体溶解。分装于2 支试管中，一支加入1～2 滴 5% 鞣酸溶液，观察有无白色沉淀的生成。另一支加1～2滴10%盐酸（或10%硫酸），再加入等体积的KI-I2溶液，即产生红棕色沉淀；加入过量的NaOH时，沉淀又溶解。

（2）氧化：取样品液2-4 mL置于瓷皿中，加热蒸去溶剂，加盐酸1 mL溶解，加入KClO3 0.1 g，在通风厨内加热蒸发，待干，冷却后滴加氨水数滴，观察并记录颜色有何变化？

4．咖啡因含量的测定

（1）吸收曲线的绘制：用吸量管吸取咖啡因标准储蓄液（0.5 mg·mL-1）2.0 mL放入50 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，充分摇匀，用1 cm比色皿，以无水乙醇为参比，在200～300 nm之间用紫外分光光度计进行波长扫描，在273 nm处咖啡因在无水乙醇中有最大吸收波长。

（2）咖啡因标准曲线绘制：用吸量管分别移取咖啡因标准储备液（0.5 mg·mL-1）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分别放入6只50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，得到浓度为5 mg·L-1，10 mg·L-1，15 mg·L-1，20 mg·L-1，25 mg·L-1，30 mg·L-1的系列标准溶液，在紫外分光光度计上测其在273 nm处的吸光度A值，然后以咖啡因的浓度为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程。

（3）咖啡因的含量测定: 准确称取提取物咖啡因2.5 mg，置于25 mL容量瓶中, 用用无水乙醇溶解到刻度，吸取2 mL置于10 mL容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，配成质量浓度为20 mg·L-1的溶液，以无水乙醇为空白，1 cm比色皿在273 nm处测定其吸光度A值，然后按标准曲线，算出咖啡因的含量。

六、操作要点及注意事项

1．滤纸筒的直径要略小于抽提筒的内径，以既能紧贴器壁，又能方便取放为宜，其高度一般要超过虹吸管，但是茶叶末不得高于虹吸管，以免堵塞虹吸管。

2．索式提取器的虹吸管极易折断，装置装置和取拿时必须特别小心。

3．蒸馏回收乙醇时不要蒸得太干，剩约10－15 mL，否则残液很粘转移时损失较大。

4．提取过程中，生石灰起吸水和中和作用，以除去部分酸性杂质。

5．蒸发时一定要蒸干，如果留有少量水分，将会在升华时带来烟雾，污染器皿，咖啡因也会损失。若遇此情况，应撤去火源，用滤纸迅速擦干漏斗内的水珠，然后继续升华。注意研磨，最后呈粉末状，但焙炒不能过火。

6．蒸发皿上覆盖刺有小孔的滤纸是为了避免已升华的咖啡因回落入蒸发皿中，纸上的小孔应保证蒸气通过。漏斗颈塞棉花, 为防止咖啡因蒸气逸出。

7．升华操作是实验成败的关键。升华过程中始终都应严格控制用小火间接加热，如温度太高，会发生炭化，从而将一些有色物带入产物，导致产品不纯和损失；温度低，咖啡因又不能升华。进行再升华时，加热温度也应严格控制，否则使被烘物大量冒烟，导致产物不纯和损失。升华时不要开启漏斗。

8．咖啡因可被过氧化氢、氯酸钾等氧化剂氧化，生成四甲基偶嘌呤（将其用水浴蒸干，呈玫瑰色），后者与氨作用即生成紫色的紫脲铵。该反应是嘌呤类生物碱的特性反应。

七、数据记录和处理

1．咖啡因的性状：；

2．咖啡因的产量：；

3．茶叶中咖啡因的含量：；

4．咖啡因含量的测定：

浓度(mg·L-1)

吸光度

5

10

15

20

25

30

待测样

第一次测定值

第二次测定值

平均值

测量波长λmax= nm；

比色皿b=cm

5．绘制标准曲线。

八、思考题

1．试述索氏提取器的萃取原理，它与一般的浸泡萃取相比，有哪些优点？

2．索式提取器有哪几部分组成？

3．为什么要将固体物质（茶叶）研细成粉末？

4．生石灰的作用是什么？

5．升华装置中，为什么要在蒸发皿上覆盖刺有小孔的滤纸？漏斗颈为什么塞棉花？

6．升华前为什么必须除净水分？

7．本实验进行升华操作时，应注意什么？