茶树咖啡碱合酶cDNA在大肠杆菌中的表达

2021-02-23 21:02:48热度:188°C

通过RT-PCR法扩增出茶树咖啡碱合酶(TCS)cDNA编码区全序列，并将其克隆到表达载体pET32a(+)中，得到重组质粒pET-TCS，在表达宿主菌B121trxB(DE3)中高效表达，产生相对分子质量约为62000的融合蛋白。该融合蛋白包括112个氨基酸残基的硫氧还原蛋白及370个氨基酸残基的茶树TCS蛋白。实验结果表明，随着诱导时间的延长，表达的融合蛋白产量逐渐增加，表达蛋白总量最高可达到菌体总蛋白的39．14％；在15、25和37℃ 3个不同的诱导温度下，均能诱导产生融合蛋白，而且产生的总量及其可溶性部分所占比例均随诱导温度升高而增加；在菌体的各个部位中，融合蛋白主要在细胞质中以可溶的形式进行表达，有少量在外周质中表达或以包涵体形式在细胞质中表达。另外，体外酶促反应表明，表达的融合蛋白能催化可可碱甲基化生成咖啡碱，具有正常的生物学活性。

完成机构：[1]安徽农业大学农业部茶叶生物化学和生物技术重点开放实验室，安徽合肥230036 [2]安徽省教育学院，安徽合肥230061

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